สล็อตแตกง่าย ยีน (สีแดงและสีขาว) ที่จับกับท่อนาโนคาร์บอนสามารถแพร่กระจายไปยังเซลล์พืชได้ง่าย โดยแสดงออกราวกับว่าเป็นยีนของเซลล์เอง ในกรณีนี้ การใส่ยีนสำหรับโปรตีนเรืองแสงสีเขียวจะทำให้ใบเป็นสีเขียว ท่อนาโนมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 1 นาโนเมตรและยาวหลายร้อยนาโนเมตร (ภาพ: กราฟิก UC Berkeley โดย Ella Marushchenko)
การแทรกหรือปรับแต่งยีนในพืชเป็นศิลปะมากกว่าวิทยาศาสตร์
แต่เทคนิคใหม่ที่พัฒนาโดย University of California, Berkeley นักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างพันธุวิศวกรรมพืชชนิดใดก็ได้ โดยเฉพาะการแก้ไขยีนด้วย CRISPR-Cas9 ที่ง่ายและรวดเร็ว
ในการถ่ายทอดยีน นักวิจัยได้ต่อกิ่งเข้ากับท่อนาโนคาร์บอน ซึ่งมีขนาดเล็กพอที่จะลอดผ่านผนังเซลล์ที่แข็งแรงของพืชได้อย่างง่ายดาย จนถึงปัจจุบัน พันธุวิศวกรรมพืชส่วนใหญ่ทำได้โดยการยิงยีนเข้าไปในเนื้อเยื่อ ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า biolistics หรือส่งยีนผ่านแบคทีเรีย ทั้งสองประสบความสำเร็จเพียงไม่กี่เปอร์เซ็นต์เท่านั้น ซึ่งเป็นข้อจำกัดสำคัญสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่ต้องการสร้างพืชที่ทนต่อโรคหรือความแห้งแล้ง หรือเพื่อวิศวกรรมพืช เพื่อให้สามารถแปลงเป็นเชื้อเพลิงชีวภาพได้ง่ายขึ้น
อย่างไรก็ตาม นาโนทิวบ์ประสบความสำเร็จอย่างสูงในการส่งยีนเข้าไปในนิวเคลียสและเข้าไปในคลอโรพลาสต์ ซึ่งเป็นโครงสร้างในเซลล์ที่ยากต่อการกำหนดเป้าหมายโดยใช้วิธีการในปัจจุบัน คลอโรพลาสต์ซึ่งมีจีโนมแยกจากกัน แม้ว่าจะมีขนาดเล็ก ดูดซับแสงและเก็บพลังงานไว้ใช้ในอนาคต โดยปล่อยออกซิเจนในกระบวนการ เทคนิคการส่งยีนอย่างง่ายจะเป็นประโยชน์สำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่กำลังพยายามปรับปรุงประสิทธิภาพของการจับพลังงานแสงเพื่อเพิ่มผลผลิตพืชผล
ท่อนาโนไม่เพียงแต่ปกป้อง DNA จากการถูกทำลายโดยเซลล์ แต่ยังป้องกันไม่ให้ถูกแทรกเข้าไปในจีโนมของพืชอีกด้วย เป็นผลให้เทคนิคนี้อนุญาตให้ดัดแปลงหรือลบยีนที่ในสหรัฐอเมริกาและประเทศอื่นนอกเหนือจากสหภาพยุโรปจะไม่เรียกการกำหนด “ดัดแปลงพันธุกรรม” หรือ GMO
Markita Landry ผู้ช่วยศาสตราจารย์ด้านวิศวกรรมเคมีและชีวโมเลกุลของ UC Berkeley กล่าวว่า “ข้อดีอย่างหนึ่งคือประหยัดเวลาด้วยเทคโนโลยีเช่นนี้ “แต่ฉันคิดว่าความก้าวหน้าที่สำคัญคือความสามารถในการส่งยีนไปยังพืชข้ามสายพันธุ์ได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ และในลักษณะที่สามารถทำให้เกิดการสร้างสายพันธุ์พืชดัดแปลงพันธุกรรมโดยไม่ต้องรวม DNA จากต่างประเทศเข้ากับจีโนมของพืช”
การใช้งานที่สำคัญคือการแก้ไขยีน CRISPR-Cas9: ส่งยีนสำหรับ Cas9 ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่กำหนดเป้าหมายและตัด DNA พร้อมกับฉลากที่อยู่ของ RNA–Cas9 คู่มือการเข้ารหัส DNA เพื่อแก้ไขยีนเฉพาะด้วยความแม่นยำสูง และ DNA ที่จับกับท่อนาโนนั้นแข็งแกร่งมาก
“เราประเมินความเสถียรของโครงสร้างและต้นทุน และในทั้งสองกรณี สิ่งนี้ใช้ได้กับวิทยาศาสตร์การซ่อมรถ” Landry กล่าว “คุณสามารถใส่สิ่งเหล่านี้ในซองจดหมายและส่งไปได้ทุกที่ คุณไม่จำเป็นต้องมีตู้เย็น ปืนยีน แบคทีเรีย คุณไม่จำเป็นต้องทำงานกับพวกเขามากนัก และพวกมันก็เสถียรเป็นเวลาหลายเดือน เราสามารถสร้างพวกมันได้ในปริมาณมาก แช่แข็งพวกมัน ละลายพวกมัน พวกมันเป็นสิ่งเล็กๆ ที่ทนทาน”
Landry และเพื่อนร่วมงานของเธอจะรายงานผลทางออนไลน์ในวันที่ 25 กุมภาพันธ์ ล่วงหน้าก่อนที่จะตีพิมพ์ในวารสารNature Nanotechnology
การจัดส่ง CRISPR
Landry ค้นพบว่าท่อนาโนสามารถลื่นไถลผ่านผนัง
เซลล์พืชได้อย่างง่ายดาย ซึ่งขึ้นชื่อว่าเป็นชั้นที่ทนทาน ในขณะที่พยายามติดฉลากเซลล์ด้วยเซ็นเซอร์นาโนทิวบ์ เซ็นเซอร์จะเข้าไปอยู่ในเซลล์ ไม่ใช่ที่ผิวเซลล์
เธอเห็นวิธีการพลิกกลับในทันทีเพื่อส่งยีนไปยังพืช วิธีการในปัจจุบันนั้นยุ่งยากและให้ผลตอบแทนต่ำ การใช้ปืนยีนเป็นอันตราย มันเหมือนกับการเจาะรูในเซลล์พืชและหวังว่าทั้งยีนและเซลล์ของคุณจะมีชีวิตรอด พืชบางชนิดไม่สามารถติดเชื้อโดย Agrobacterium ที่มียีนเป็นพาหะ และอีกเทคนิคหนึ่งที่ใช้ไวรัสที่ทำให้เกิดโรคเพื่อส่งยีน ใช้ได้กับพืชช่วงที่แคบกว่าและเสี่ยงต่อการแทรก DNA ของไวรัสเข้าไปในจีโนมของพืช ทั้งหมดต้องได้รับการปรับแต่งสำหรับโรงงานแต่ละแห่ง และ DNA ที่ส่งมาถูกรวมเข้ากับจีโนม: คำจำกัดความของ GMO
ด้วยความกระตือรือร้นที่จะลอง Landry และเพื่อนร่วมงานของเธอได้ห่อหุ้มยีนสำหรับโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) รอบท่อนาโนและฉีดเข้าไปในใบ arugula อินทรีย์ที่ซื้อจากตลาดอาหารทั้งหมดในท้องถิ่น ภายในหนึ่งวัน เซลล์พืชเรืองแสงเป็นสีเขียวภายใต้แสงยูวี แสดงว่ายีน GFP ได้รับการถ่ายทอดและแปลเป็นโปรตีน ราวกับว่าเป็นยีนของพืช
อย่างไรก็ตาม ผลกระทบนี้คงอยู่เพียงไม่กี่วัน อย่างไรก็ตาม อาจเป็นเพราะโปรตีนถูกนำกลับมาใช้ใหม่ และ DNA จะค่อยๆ เสื่อมสภาพลง
อายุขัยสั้นไม่ใช่ข้อเสีย
“ส่วนหนึ่งของสิ่งที่ทำให้แพลตฟอร์มไม่เหมือนใครคือการแสดงออกนั้นเกิดขึ้นชั่วคราว เมื่อเรามองเข้าไปในกล้องจุลทรรศน์เจ็ดถึง 10 วันต่อมา นิพจน์นั้นหายไป การเรืองแสงก็หายไป นั่นไม่ใช่กรณีของ Agrobacterium” Landry กล่าว สำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่ศึกษาวิธีการทำงานของพืช การแสดงยีนในช่วงเวลาสั้นๆ สามารถบอกพวกเขาได้มากเกี่ยวกับบทบาทของยีนในเซลล์
“เพื่อให้สิ่งนี้เป็นแพลตฟอร์มที่มีประโยชน์อย่างกว้างขวาง แต่เราจำเป็นต้องแสดงโปรตีนที่มีผลถาวรต่อจีโนมนิวเคลียร์ในตัวของมันเอง” เธอกล่าวเสริม
แผนของเธอคือการบรรจุ DNA ลงในพลาสมิดสายเดี่ยวที่ติดอยู่กับท่อนาโนคาร์บอน ภายในสองหรือสามวันหลังจากแพร่กระจายเข้าไปในเซลล์ ทั้งโปรตีน Cas9 และ CRISPR Guide RNA จะถูกแสดงออก ทำให้พวกเขาเชื่อมโยงกันเพื่อสร้างไรโบนิวคลีโอโปรตีนเชิงซ้อนที่แก้ไขจีโนมอย่างถาวร เธอไม่พบผลกระทบที่เป็นพิษจากท่อนาโน
“ตอนนี้คุณมีโรงงานที่ได้รับการแก้ไขแล้ว แต่จะถือว่าไม่ใช่จีเอ็มโอนอกยุโรป” เธอกล่าว
การชาร์จนาโนทิวบ์
เธอและเพื่อนร่วมงานได้ทดสอบการนำส่งนาโนทิวบ์ในพืชชนิดอื่น เช่น ยาสูบ กรรมพันธุ์พืช ฝ้ายซึ่งมีจีโนมยากต่อการแตกร้าวฉาวโฉ่ และข้าวสาลี รุ่นที่ดัดแปลงพันธุกรรมของพืชเหล่านี้มีวางจำหน่ายแล้ว แต่เทคนิคที่เข้าใจง่ายสามารถเร่งการเปิดตัวของยีนใหม่และเป็นประโยชน์ได้ ตัวอย่างเช่น ยาสูบได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมเพื่อผลิตยา เช่น ยาต้านมะเร็ง
แม้ว่า Landry และเพื่อนร่วมงานของเธอจะยังไม่เข้าใจอย่างถ่องแท้ว่าการจัดส่งท่อนาโนทำงานอย่างไร แต่การป้อนท่อนาโนอย่างง่ายก็ไม่น่าแปลกใจเลย ผนังเซลล์ของพืชยอมให้สิ่งต่างๆ หลุดเข้าไปได้ง่าย หากมีขนาดเล็กกว่า 5 ถึง 20 นาโนเมตร ซึ่งน้อยกว่าขีดจำกัดเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมขนาด 500 นาโนเมตรมาก ท่อนาโนมีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 นาโนเมตร แม้ว่าจะยาวประมาณ 300 นาโนเมตร แต่ก็มีพื้นที่เพียงพอสำหรับติดยีนหลายสิบตัว เซลล์พืชมีขนาดประมาณ 10,000 นาโนเมตร
เธอและเพื่อนร่วมงานในห้องแล็บได้ลองใช้เทคนิคต่างๆ
ในการยึด DNA เข้ากับท่อนาโน และพบว่าการผูกมัดที่แน่นที่สุดได้ผลดีที่สุด เมื่อนักวิจัยให้ประจุบวกกับท่อนาโนก่อนที่จะแนะนำ DNA มันติดเหมือนกระดาษกับหวีที่มีประจุไฟฟ้าสถิต
ตอนนี้เธอกำลังทำการทดลองกับอนุภาคนาโนของ DNA origami เพื่อให้เข้าใจมากขึ้นว่าเกิดอะไรขึ้นภายในเซลล์พืชหลังจากที่ท่อนาโนและ DNA ป้อนเข้าไป และกำลังทดลองส่งท่อนาโนไปยังพืชที่มีโมเลกุลประเภทอื่นๆ โดยเฉพาะ RNA และโปรตีน
“สิ่งมหัศจรรย์เกี่ยวกับท่อนาโนคาร์บอนเหล่านี้คือพวกมันสามารถผ่านผนังเซลล์และเข้าไปในนิวเคลียสหรือเข้าไปในคลอโรพลาสต์ได้ มันเป็นความก้าวหน้าครั้งใหม่ที่ช่วยให้เราสามารถวางเครื่องมือสำหรับการแก้ไขจีโนมได้อย่างแท้จริง” Brian Staskawicz ศาสตราจารย์ด้านชีววิทยาพืชและจุลินทรีย์และผู้อำนวยการด้านวิทยาศาสตร์เพื่อการเกษตรของ Innovative Genomics Institute ซึ่งให้ทุนสนับสนุนการทำงานเพิ่มเติมในการส่งมอบ CRISPR โดย Landry และทีมงานของเธอ “ขั้นตอนต่อไปคือ เราสามารถส่งมอบโปรตีนไรโบนิวคลีอิกหรือเราสามารถส่ง mRNA หรือ DNA ที่จะเข้ารหัส CRISPR-Cas9 ได้จริงหรือไม่”
ที่มา: มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย – เบิร์กลีย์ สล็อตแตกง่าย
